Buna göre; 300 gr soyulmuş ve dilimlenmiş patates 1.5 lt su içinde bir kapta kaynatılarak haşlanır ve süzülür. Ardından 20 gr dextroz ile 20 gr agar ilave edilip süzüntü 1 lt’ye tamamlanıp pH’sı 6.0-7.0’ye ayarlandıktan sonra tekrar ısıtılarak kaynama noktasında, petri kaplarına doldurularak otoklavda 121°Cde 25-30 dakika sterilize edilir. Sterilizasyon sonrası kaplar steril aşılama kabinine alınarak burada ortamlara soğuduktan sonra ok uçlu bir iğneyle spor aşılaması gerçekleştirilir. Aşılamada kullanılacak 2. bir yol ise doku kültürü yöntemidir. Bu amaçla steril kabine alınan mantar elle koparılarak ikiye ayrılır ve iç dokudan alınan 0.5 xl.O cm ebadındaki bir parça yine petri kaplarındaki ortamlara aşılanır. Aşılama sonrası kültürler 24 °C deki iklim dolabında inkübasyona tabi tutulur ve yaklaşık 2-3 gün sonra sporlarda çimlenme başlar, 7 ile 9 cm çapındaki petrilerde gelişme 20-25 günde tamamlanmaktadır ve süre sonunda besin ortamının üzeri pamuk gibi Shiitake nin miselleriyle kaplanır.
Tohumluk Miselin Hazırlanması Yukarıda açıklanan şekilde hazırlanan miseller doğrudan üretimde kullanılamaz. Bunun en önemli nedeni ağar maddesinin çok pahalı oluşunun yanında, agarlı ortamın yetiştirme ortamlarına ekimi sırasında enfeksiyon riskinin daha yüksek oluşudur. Shiitake mantarının tohumluk misellerinin hazırlanmasında sardırma materyali olarak daha çok dal parçaları, talaş ile buğday, çavdar, darı gibi hububatların danelerinden yararlanılmaktadır. Tanegoma adı verilen ve meşe, kavak gibi ağaçların dallarından 1-1.5 cm çapında, 1.5-2.0 cm uzunluğunda çubuk şeklinde kesilen dal parçalarıyla talaş ortamı kültür kütüklerinin, hububat danelerinden hazırlanan miselleri ise sentetik ortamların aşılanmasında kullanılmaktadır. Dal parçalarının sterilizasyondan 1 gün önce suda bırakılması nem düzeylerinin artması bakımından varalı olacaktır. Kültür kütüklerinde talaş miseli tercih etmenin nedeni, hububat danelerine sardırılmış miselle yapılan aşılama sonrası karınca ve böcek gibi zararlıların hububatı yemesi ve aşılamanın etkinliğinin ortadan kalkmasından ileri gelmektedir. ‘ Talaş miseli hazırlamada pratik olarak 4/5 meşe talaşı+ 1/5 buğday kepeği kullanılabilir. Kuru kuruya iyice karıştırılan maddenin pH durumuna göre gerekli kireç ilavesi yapıldıktan sonra nem oranı % 60-65’e çıkarılmalıdır. Karışım; talaşın suyunu 1-2 saat emmesini sağladıktan sonra kullanılmalıdır. Dane miselin hazırlanmasında ise, işletmenin ihtiyacına göre değişmekle beraber burada 10 kg’lık bir miktar esas alınmıştır. Buna göre bir kaynatma kazanında 15 lt su kaynadıktan sonra 10 kg buğday haşlanır. Buğdayın haşlanma miktarı az olmamalı, ancak aşırı kaynatılmayla da buğdaylar patlatılmamalıdır. En iyi kaynatma süresi buğdayın yemeklik patates haşlanmasında olduğu gibi kabuklarının soyulmayıp ancak iç kıvamının yenecek hale geldiği zaman kadardır. Bu şekilde haşlanan buğday bir elekte süzülür ve içerisine kireçle çamurlaşmayı önlemek için 1-2 kg alçı ilave edilir.
Yukarıda açıklanan şekilde hazırlanan her üç materyal de 1-1.5 lt’lik cam şişe veya kavanozlara ya da polipropilen torbalara 2/3 oranında doldurulup ağızları pamukla mühürlendikten sonra otoklavda 1.5-2 saat sterilize edilir. Sterilizasyon sonrası şişeler steril aşılama kabinine getirilir. Burada UV ışığı altında 1 gün bekletildikten sonra daha önce hazırlanmış saf kültürlerden alınan yaklaşık 1-1.5 cm’lik misel gelişmiş agar parçaları şişelerin ağzı hafifçe açılarak ortamlara aşılanır. Her bir şişeye iki kültür aşılama, misellerin kısa sürede sarması bakımından daha iyidir. Aşılanması tamamlanan şişeler 24°Cdeki iklim dolabı veya odasında inkübasyona tabi tutulur ve şişe büyüklüğü ile kullanılan ortamın miktarına bağlı olarak 20-30 gün içerisinde miseller tamamen gelişecektir. Bu şekilde hazırlanan ortamlar ” ana kültür ” (tane misel için) adını almakta, yetiştirme ortamlarının direkt aşılanmasında kullanılabilmesine rağmen içinde bulunan agar nedeniyle pahalıya satılmakta, aslında ana kültürler yeni tohumların üretilmesinde yer almaktadır. Bir ana kültür şişesinden 50-60 yeni şişe aşılanabilmekte, bu aşılanan şişeler de yine ana kültür gibi değerlendirilerek, aşılandığında 2500-3000 adet yeni tohumluk misel şişesi hazırlanabilmektedir. Ancak, sürekli alt kültür yapma misellerde dejenerasyon olması sebebiyle de tercih edilmemeli, 3-4 alt kültürden sonra yeni saf kültürlerle çalışılmalıdır. Shiitake tohumluk miselleri hemen kullanılmayacaksa +4°C’de buzdolabı koşullarında saklanmalıdır. Saklama süresi 3-4 aydır ve bu sürenin sonunda hububat danelerinde yumuşamaya paralel olarak misellerde yaşlanma görülecek ve tohumlar elden çıkacaktır. Sırasıyla talaş misel ile odun parçalarındaki misellerin saklanma süresi biraz daha uzundur. Saf kültürlerde +4°C’de muhafaza edilmelidir. Cam tüplerde hazırlanan ortamların petri kaplarında hazırlanan ortamlara oranla dayanımları daha uzun olup, petri kaplarının etrafı plastik filmle çevrilse bile içinde bulunan besi yerlerinin zamanla kuruması nedeniyle bu saf kültürlerden de zamanla alt kültür yapmak faydalı olacaktır.
